近日，我院应光国教授团队高方舟等人与清华大学深圳国际研究生院李炳教授合作关于垃圾填埋场中抗生素抗性基因的最新研究发表在环境领域期刊《Environment International》。
图文摘要
亮点
• 垃圾填埋场的抗性组包含29种ARG类型的1,403种ARG亚型。
• 49种ARG亚型被列为未来监测的首要重点。
• K. pneumoniae、A. nosocomialis和E. coli是渗滤液中常见的病原体。
• Pseudomonadaceae的多个属是主要的污染物降解抗性病原菌。
• 污染物降解抗性病原菌的富集突显了垃圾填埋场中的环境选择压力。
摘要
城市垃圾填埋场是微生物耐药性（AMR）的热点环境，同时也是污染物降解细菌的重要栖息地。然而，填埋场中抗生素抗性基因（ARGs）的高度多样性阻碍了对受影响环境中AMR风险的评估。更值得关注的是，在这些极度污染的环境中，是否存在抗生素抗性细菌与污染物降解细菌的协同选择或富集，仍然了解甚少。本研究收集了来自中国22个城市垃圾填埋场的32个原始渗滤液样本和45个固体废物样本的宏基因组数据集。研究探索了抗生素抗性组、抗生素抗性细菌以及污染物降解细菌，并将其与其他环境类型进行了比较。结果显示，填埋场中的抗生素抗性组包含1,403种ARG亚型，其总丰度超过自然环境的水平，并达到人类粪便和污水中的水平。其中，基于在填埋场中的富集程度、可移动性以及在病原体中的存在等标准，有49种亚型被列为未来监测的首要ARGs。通过与污染较轻的河流环境进行比较，研究揭示了填埋场中具有污染物降解潜力的抗生素抗性细菌的富集现象。Pseudomonadaceae、Moraxellaceae、Xanthomonadaceae和Enterobacteriaceae的细菌最值得关注，因为72.2%的ARG宿主归属于这些科。Klebsiella pneumoniae）、Acinetobacter nosocomialis和Escherichia coli是原始渗滤液中丰富的多重耐药性致病菌（约占总微生物群的10.2%），但它们很少携带污染物降解基因。值得注意的是，属于Pseudomonadaceae的几个细菌属相比其他细菌表现出了更高的抗生素抗性、致病性以及污染物降解潜力。总体而言，这些发现突出了污染物降解抗生素抗性病原体的环境选择作用，并为城市垃圾填埋场中的AMR风险提供了重要见解。
研究结果
1. 抗生素抗性组在固体废弃物和原始渗滤液中存在显著差异。
在本研究中，共检测到1,403种抗生素抗性基因（ARG）亚型，属于29个类型。固体废物和渗滤液中的ARG亚型数量分别为1,127和1,126，其中850种ARG亚型在两种栖息地中共享。稀疏曲线表明，固体废物中的抗性组多样性高于渗滤液，并且如果增加样本数量和测序深度，可能会检测到更多的ARG亚型（图1b）。在垃圾填埋场中检测到的ARG亚型数量超过了其他环境类型（图1b）。除了多样性外，固体废物和渗滤液中的抗性组成分显著不同（图1c），且固体废物中的相对丰度显著高于渗滤液（均值：1.90 copies/cell vs. 1.09 copies/cell；图1d）。值得注意的是，这些水平高于牛粪、污水处理厂（WWTP）、土壤、水和沉积物中的水平，甚至达到了人类粪便和污水中的水平。具体而言，MLS、磺胺类、氨基糖苷类、多重耐药性和四环素抗性基因是两种栖息地中占主导地位的ARG类型，其中14种类型在某一栖息地中显著富集（图1e）：MLS和四环素抗性基因在渗滤液中更为丰富，而其他基因在固体废物中更为丰富。在亚型层面，bacA、sul1和sul2是最常见的ARGs，并且152种亚型在某一栖息地中显著富集（图1f）。三分之二的富集亚型在固体废物中更为丰富，包括所有氯霉素和多重耐药性基因以及大多数四环素抗性基因。
图1. 中国城市垃圾填埋场固体废物和渗滤液中的抗生素抗性组。（a）垃圾填埋场和样本量的分布；（b）显示固体废物和渗滤液中抗生素抗性基因（ARG）亚型数量的稀有曲线，并与其他环境类型进行比较。维恩图显示了媒体之间独特和共享的亚型数量；（c）固体废物和渗滤液之间抗性组的非度量多维标度分析。椭圆阴影是0.95水平的置信区间，***表示0.001水平的显著变化；（d）两种介质之间总抗性组的相对丰度；（e）固体废物和渗滤液中12种主要ARG类型的比例。*代表0.05水平的显著变化，***代表0.001水平的显著差异；（f）固体废物或渗滤液中富集的ARG亚型的组成。标记了显著富集的ARG亚型。粗体斜体的ARG亚型是本研究中确定的首要ARG。ARG亚型较少的ARG类型显示在灰色圆圈中。
2. 对优先监测ARGs的分析突出了垃圾填埋场地下水污染。
垃圾填埋场中有63种核心ARG亚型，其中36种亚型由两个栖息地共享。共确定了属于八种类型的49种最高优先级亚型，其中八种亚型与之前定义的风险等级I ARGs重叠（图2a-b）。20种亚型在固体废物或渗滤液中显著富集，19种亚型因在两种栖息地都富集而受到最多关注。为了评估监测井地下水的环境风险，将最优先的ARG分为五类，并将其在垃圾填埋场的总体丰度与河流环境中的总体丰度进行了比较（图2c）。结果表明，地下水中所有类别的含量均显著高于河水和沉积物中的含量，而最优先的ARG比其他类别具有更高的区分性，表明了城市垃圾填埋场对地下水的影响。值得注意的是，垃圾填埋场和河流环境中都存在几个最优先的ARG，这意味着AMR风险范围更广，但不仅限于垃圾填埋场。
图2. 垃圾填埋场中最优先抗生素抗性基因（ARG）的鉴定。（a）工作流程和每个步骤中选定的ARG数量；（b）与风险等级为I的ARGs进行比较的最优先ARG名单；（c）监测井地下水、河水和河流沉积物中ARGs类别的相对丰度。
3. 垃圾填埋场中抗性基因的宿主种类广泛。
总共组装了840个携带193个ARG亚型的重叠群（图3a）。大多数氨基糖苷类、磺胺类、氟苯尼考、四环素和氯霉素抗性基因位于质粒上，而多药类、大环内酯-林克酰胺-链霉素类、β-内酰胺类和杆菌肽抗性基因更常见于染色体上。预测了一些ARG（例如aadA、erm（A）、erm（B）和sul2）位于质粒和染色体上。携带ARG的重叠群分为16门123科（图3a）。约43.6%的重叠群被归类为变形杆菌属，其中与病原体相关的科，包括Pseudomonadaceae、Moraxellaceae和Enterobacteriaceae，是主要的宿主，尤其是多药和氨基糖苷类抗性基因。在携带ARG的重叠群中，仅在质粒数据库中搜索到80个，这表明大部分质粒重叠群可能尚未得到研究。比对到的质粒属于90个物种，其中K. pneumoniae, Escherichia coli and Aeromonas salmonicida等病原体种类占多数（图3b）。在ESKAPE细菌中共检测到595个携带ARG的重叠群（图3c）。其中质粒携带的重叠群比染色体携带的重叠群更普遍，三分之二的重叠群中的ARG与MGE有关。所有ESKAPE细菌共有181个重叠群，这些重叠群中经常存在一些ARG（例如tet（M）、mph（A）、APH（6）-Id、erm（B）、APH（3′'）-Ib、qacEdelta1、sul1、sul2、tet（A）和aadA，图3d）。
图3. 细菌宿主和抗生素抗性基因（ARG）的可移动潜力。（a）长度超过5000 bp的重叠群中ARG的来源、位置和宿主；（b）质粒携带ARG的前14个宿主细菌；（c）检测ESKAPE细菌中携带ARGs的重叠群；（d）在所有ESKAPE细菌中检测到的主要ARG亚型。
4. 耐药病原菌属于Proteobacteria中的数个科。
在渗滤液（3201 MAGs）和固体废物（1515 MAGs）样本中共获得4716 MAGs。它们主要来自Proteobacteria、Bacteroidota、Firmicutes_A、Firmicutes、Actinobacteriota和Firmicutes_G（图4a）。固体废物中携带ARG的MAGs的比例（22.3%）明显高于渗滤液中的比例（5.7%）。根据对重叠群的分析，携带ARGs的MAGs主要属于Proteobacteria、Bacteroidota和Firmicutes（图4b）。在较低的分类水平上，Pseudomonadaceae（包括Pseudomonas_A、Pseudomonas_C、Pseudomonas_D、Pseudomonas_E和Pseudomonas_H）以及Moraxellaceae（包括Acinetobacter和Psychrobacter）是主要的宿主。随后探索了ARG、BRG、MRG和VFG的共存，以分析推定的ARP（图4c）：共有870个MAG携带三类中的一类，142个MAG携带所有三类，其中134个MAG被归类为Proteobacteria，包括16科、38属和63种。最主要的寄主科是Pseudomonadaceae，含有70个MAGs，分为7属26种。其他主要宿主包括16个MAGs来自5种Acinetobacter；11个MAGs来自4个Xanthomonadaceae的属；8个MAGs来自5个Burkholderiaceae的属。
图4. 潜在耐药细菌基因组分析。（a）MAG的基本信息；（b）抗生素耐药细菌的来源和宿主分类；（c）MAGs中抗生素抗性基因（ARG）、毒力因子基因（VFG）和杀生剂/金属抗性基因（BRG/MRG）的共存。蓝色节点代表MAGs，线条代表MAGs携带的基因类别。
5. 抗性基因与可移动遗传元件共存暗示了可转移潜力。
有47个MAG携带至少三种ARG类型（被视为多重耐药菌，图5）。在Proteobacteria中，大多数ARG与MGE共定位，只有一种未分类的QZLD01 MAG不携带VFG。Pseudomonas_A携带杆菌肽、β-内酰胺和多药类抗性基因。Proteus vulgaris携带MLS、多药、多粘菌素和四环素抗性基因。三种多重耐药MAGs被分为A. nosocomialis、E. coli和K. pneumoniae。它们在渗滤液中的相对丰度较高（E. coli：7.0 %; K. pneumoniae：10.2%和A. nosocomialis：2.6 %）比固体废物（E. coli：2.0 %; K. pneumoniae：4.1%和A. nosocomialis：0.5%）。相比之下，属于其他门的MAGs极少携带BRGs、MRGs和VFGs。至少90种ARGs被三个以上MAG共有，其中60%ARGs与MGE共定位。BacA是最常见的亚型，由110个MAGs携带，横跨Proteobacteria、Firmicutes、Desulfobacterota_I和Firmicutes_A.。此外，在多个物种的20多个MAGs中检测到mexK、MexF、mel、erm（A）和floR。在共享的ARG中，在六种物种中检测到qacEdelta1-sul1的排列。其遗传环境在P. maritimus中最为复杂。在unassigned Rhodomicrobiaceae和Corynebacterium glutamicum中检测到aadA-qacEdelta1-sul1-转座酶的排列，在P. formosensis中存在AAC（6′）-IIa-qacEden1-sul1-IS6的排列。
图5. 城市垃圾填埋场中的多药耐药细菌，以及移动基因元件（MGE）、毒力因子基因（VFG）和杀生剂/金属抗性基因（BRG/MRG）的检测。
6. 污染物降解-耐药病原菌的富集凸显了环境中的选择压力。
分别有121、444、130和200个MAGs携带塑料、持久性有机污染物（POPs）、芳香族和烷烃降解基因，涵盖了7个门的54个科（图6a）。他们总体上占MAGs总数的14.3%。其中，45个塑料降解MAG、131个POPs降解MAG、93个芳香族降解MAG和86个烷烃降解MAG至少含有一种ARG。塑料降解基因主要涉及PCL、聚羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯-共戊酸酯和PET。POPs降解基因主要涉及滴滴涕、多氯联苯、全氟辛酸和全氟辛烷磺酸。碳氢化合物降解基因主要涉及联苯、原儿茶酸酯、邻苯二酚和苯甲酸酯。值得注意的是，携带ARG的MAGs中有很大一部分也携带污染物降解基因，其中20个携带所有污染物降解基因类别的MAGs来自Pseudomonadaceae。
Enterobacteriaceae、Moraxellaceae、Pseudomonadaceae和Xanthomonadaceae是最值得关注的耐药病原菌（图6b）。它们在固体废物中的总相对丰度明显高于渗滤液中的相对丰度。在Pseudomonadaceae中，Pseudomonas_A不携带塑料降解基因，但携带POPs和碳氢化合物降解基因，其中一半还携带DDT降解基因。Pseudomonas_C携带的POPs和碳氢化合物降解基因比其他属少，只有P. caeni和P. sp012719655携带塑料降解基因。大多数Pseudomonas_D携带PET、PCL和碳氢化合物降解基因，而携带POPs降解基因的MAGs比例较低。大多数Pseudomonas_E和Pseudomonas_H携带污染物降解基因，而Pseudomonas_K不携带。相比之下，除Moraxellaceae的Psychrobacter属外，属于其他三个科的大多数MAGs都没有携带塑料降解基因。
然后继而将本研究的结果与课题组前期在珠江河流中获得的结果进行比较。垃圾填埋场携带ARGs的MAGs的比例是河流中的两倍，垃圾填埋场的ARG宿主数量是河流的四倍。河流中只有46个携带ARGs、BRGs、MRGs和VFGs的MAGs，宿主范围（10科28种）明显窄于垃圾填埋场（20科70种）。就ARGs和污染物降解基因的共存而言，河流中携带二者的MAGs数量是垃圾填埋场的一半，携带所有类别的MAGs仅被归类为Pseudomonas_E。
图6. Enterobacteriaceae、Moraxellaceae、Pseudomonadaceae和Xanthomonadaceae中抗生素抗性基因（ARGs）和污染物降解基因（CDGs）的检测。（a）ARGs和CDGs在宏基因组组装基因组（MAGs）中的共存。灰色节点代表MAGs，线条代表MAGs携带的基因类别；（b）每种MAG的潜在功能。
主要结论
在这项研究中，我们系统地阐明了城市垃圾填埋场中多样化的抗生素耐药性，并强调了49种ARG亚型是受影响环境中未来风险评估的首要ARG。由于大部份耐药病原菌属于Proteobacteria，我们建议将最受关注的病原菌缩小到科水平的Enterobacteriaceae、Moraxellaceae、Pseudomonadaceae和Xanthomonadaceae，以及种水平的K. pneumoniae、A. nosocomialis和E. coli。我们应该提防到耐药菌和污染物降解菌在这些极度污染的环境中的共选择和富集，特别是Pseudomonadaceae的细菌属，因为它们中的许多与致病性密切相关。总的来说，这项研究的结果为城市垃圾填埋场的AMR发展提供了重要的启示。
全文引用：Gao FZ, Jia WL, Li B, Zhang M, He LY, Bai H, Liu YS, Ying GG. Contaminant-degrading bacteria are super carriers of antibiotic resistance genes in municipal landfills: A metagenomics-based study. Environment International 2025, 195, 109239. https://doi.org/10.1016/j.envint.2024.109239